junseockkoh@snu.ac.kr
비정형 단백질 혹은 단백질 부분(intrinsically disordered proteins (IDPs) or regions(IDRs))에는 전형적인 구조 도메인(structured domain)에 비하여 소수성(hydrophobic: Trp, Tyr, Ile, Phe, Val, Leu) 아미노산이 낮은 비율로 존재한다(본 논단에서는 IDP, IDR을 모두 IDR로 총칭한다) [1]. Protein folding의 주요 driving force 중 하나는 소수성 아미노산들이 solvent로부터 분리되어 자발적으로 응집되는 hydrophobic effect이므로 IDR은 정형화된 안정적인 3차원 구조를 취하지 않는 경향을 보인다 [2]. 대신, 높은 비율의 친수성(hydrophilic) 아미노산들을 통해 solvent와 호의적으로 상호작용(hydration)하여 수많은 형태의 풀린 구조로 존재한다. 이러한 ensemble내 다양한 풀린 상태들은 유사한 free energy를 갖고 있으며, 이들 간 존재하는 activation energy barrier가 낮아, 완만한 energy landscape을 형성한다 [3, 4]. 따라서 풀린 상태들 간 상호전환이 자발적이며 빠르게 일어난다.
1950-60년대 이루어진 myoglobin, hemoglobin의 구조 규명과 RNase unfolding-refolding 실험을 통해, 단백질의 기능은 이들의 정형화된 3차원 구조에 의해 결정되며, 구조를 결정하는 주요 정보는 amino acid sequence에 내재되어 있다는, (sequence)-structure-function 패러다임이 확립 되었다 [5-8]. 이러한 관점에서 IDR은 구조 도메인 간 수동적 linker 혹은 특별한 기능이 없는 단백질 말단(terminal tail)으로 인식되어 왔다. 따라서, 구조 생물학 연구에서 IDR은 주요 연구 대상이 아니었으며, 특히 x-ray crystallography 혹은 cryo-EM 연구에서는 해상도 향상을 위해 단백질 내 IDR은 많은 경우에 제외(truncation)되어왔다. 그러나 1990년대 중반부터 활발하게 이루어진 생물정보학 연구들은 진핵 세포 proteome의 약 60% 가량이 30개 이상의 아미노산을 포함하는 긴 (x-ray 결정 구조에서 일반적으로 관찰되는 구조 도메인 간 linker보다 긴) IDR을 포함하고 있음을 제시하였고 [9, 10], 특히 signaling, transcription, transport와 같이 역동적인 생체 현상이나 암에 관여하는 단백질들에 주로 긴 IDR들이 분포하고 있음을 예측하였다 [11]. 비슷한 시기에 시작된 NMR을 이용한 연구들은 signaling에 관여하는 특정 단백질 혹은 단백질 지역들이 native condition에서도 실제로 풀린 형태와 온전한 기능성을 취하고 있다는 증거를 제시하였다 [12-14]. 이후 비정형 단백질의 정제 방법, 이들의 구조 및 기능 분석에 필요한 생물물리학적 방법이 개발, 발전되어 IDR 자체 형태에 대한 연구, 다른 생체 분자와의 상호작용에 대한 연구, 그리고 최근에는 더 나아가 in vivo 에서 이들이 이루는 membrane-less organelle에 대한 연구가 활발하게 이루어짐으로써, IDR의 기능성 및 생물학적 중요성이 확립되었고, sequence-disorder-function이라는 단백질 기능에 관한 확장된 패러다임이 제시되기에 이르렀다 [15, 16]. 본 논단에서는 IDR과 생체 고분자 간 상호작용, 특히 ordered domain과는 차별화되는, 특이한 상호작용에 대한 연구를 소개하고, 이러한 상호작용들을 통해 어떻게 다양한 생물학적 현상들이 조절되는지를 논의하고자 한다.
IDR에 존재하는 특정 motif들은 표적 단백질 혹은 핵산과 결합하면서 α-helix, β-strand와 같은 2차 구조를 형성한다 [17]. 대표적인 예로, CREB(c-AMP responsive element binding protein)의 pKID(phosphorylated kinase-inducible domain)는 자체적으로는 풀린 형태로 존재하지만 CBP(CREB binding protein)의 KIX(KID interacting domain)와 상호작용 시 helix 구조로 folding 된다 [18]. Transcription factor DNA binding domain의 경우도 특이적 DNA 서열 (specific DNA sequence)에 결합 시 동반되는 folding이 X-ray, NMR 구조에서 다수 관찰되었으며, 이들에 대한 열역학적 실험 및 분석에서도 coupled folding에 관여하는 아미노산 개수가 유사하게 도출되었다 [19-21]. Coupled folding의 역할에 대한 가설로는, 첫째, IDR과 표적 생체 고분자 간 결합자리의 구조적 상보성의 확보, 둘째, binding entropy 감소를 통한 결합력(binding constant)의 미세조정이 제시되었다 [15, 17]. 특히, 결합력의 미세조정은 signaling/regulatory pathway에 관련된 생체 분자 간 상호작용의 특이성(specificity) 확보를 위한 강한 결합력과 이들의 가역적 해리 (reversible dissociation)에 유리한 약한 결합력 사이의 균형점을 이루는 데 중요한 역할을 할 것으로 추측된다.
IDR에 존재하는 결합 motif들 중 일부는 비결합 상태에서도 2차 구조를 일시적으로 형성하는데, 종양 억제 인자 p53의 amino terminal transactivation domain(N-terminal TAD)에 존재하는 IDR은 이러한 pre-formed structure의 기능성에 대한 단서를 제공한다 [22, 23]. 이 IDR은 비결합 상태에서 helix 구조를 취하는데, 구조가 형성되는 빈도는 이 구역의 보존된 proline들에 의해서 결정된다. 특정 proline(Pro27)을 alanine으로 치환하게 되면, helix 형성 확률이 증가하여 E3 ubiquitin ligase MDM2에 대한 결합력을 강화시키고, 이는 p53 signaling pathway에 관여하는 단백질-단백질 상호작용들 간 균형을 무너뜨리는 결과를 초래한다 [23]. 반면에, PUMA(p53 upregulated modulator of apoptosis)의 IDR은 pre-formed structure의 인위적인 도입에도 MCL1(induced myeloid leukemia cell differentiation protein)에 대한 결합력이 강화되지 않는다 [24]. 이러한 대조적인 결과들은 시스템과 환경에 따라서 pre-formed structure의 역할과 중요성이 결정될 수 있음을 제시한다. 혹은, 측정 기술의 한계가 표면적으로 대조되는 결과들의 원인일 수 있다. 예를 들어, pre-formed structure를 묘사하는데 가장 간단한 two-state 평형 모델을 이용하면, 실험적으로 관찰되는 결합력은 Kobserved=KbindingKc/(1+Kc)로 나타낼 수 있는데, Kc는 disordered state와 pre-formed structure간 평형상수이며, Kc/(1+Kc)은 pre-formed structure의 비율이다. 따라서, Kc/(1+Kc)의 변화량이 크지 않을 경우 혹은 실험적으로 감지 가능한 범위를 벗어난 경우는 결합력 변화의 정확한 정량이 가능하지 않을 수도 있다.
일부 IDR들은 비결합 상태의 유동성/역동성을 표적 생체 고분자와의 상호작용 시에도 유지하며 다양한 형태의 풀린 구조부터 전형적인 2차 구조까지 취할 수 있는 비균질적인 복합체(fuzzy complex)를 형성한다 [25]. 결합 상태에서도 유지되는 역동성으로 인해 이들은 두 가지 이상의 표적 생체 고분자와 각기 다른 형태를 취하며 상호작용 할 수 있는 잠재성을 갖고 있다(adaptive/promiscuous binding) [26]. 또한, 결합 motif를 구성하는 일부 지역들은 극단적인 역동성을 보이며 순간적으로 표적 단백질로부터 해리될 수 있는, 소위 "breathing(on-off) motion"을 보이는데, 이는 다른 표적 단백질들과 대체 결합할 수 있는 기회가 되기도 한다. 이러한 특징들로 인하여 fuzzy complex들은 이들이 관여하는 signaling pathway의 종류, 세포 내 위치 등 환경에 따라서 다양한 기능을 할 수 있다.
세포주기의 조절, 구체적으로 G1에서 S기로의 전환에 관여하는 Cdk2/cyclin A complex와 p27의 KID 간 상호작용이 dynamic binding의 대표적인 예시라 할 수 있다 (그림 1) [27, 28]. 이들 간 상호작용의 위치는 p27 KID의 D1, D2로 명칭 된 IDR들에 의해서 양분되어 있다. D1은 cyclin A와 상호작용하여 Cdk2/cyclin A complex의 기질 결합을 저해하며, D2는 tyrosine(Y88)을 Cdk2의 active site에 위치시킴으로써 kinase 활성을 제거한다. 두 결합 작용 모두 coupled folding을 포함하지만, D2는 결합 상태에서도 부분적인 역동성이 유지되어, Y88이 포함된 짧은 구역이 순간적으로 Cdk2의 active site로부터 분리되는 breathing motion을 보인다. 일시적으로 분리되어 외부에 노출된 Y88은 nonreceptor tyrosine kinase인 BCR-ABL에 의하여 인지, 인산화 되고, 더 이상 active site를 차단할 수 없게 된다. 이로 인해 Cdk2의 kinase 활성도가 부분적으로 회복되고, D2의 C-terminus에 존재하는 threonine(T187)을 인산화 하게 되는데, 이때 D2의 유동성으로 인해 T187과 Cdk2의 active site 간 접근성이 확보된다. 인산화 된 T187로 E3 ubiquitin ligase SCFSkp2가 모집되어 근방의 lysine들이 polyubiquitination되고, 이는 최종적으로 26S proteasome에 의한 p27의 분해 그리고 Cdk2/cyclin A complex의 활성화 및 G1에서 S기로의 전환이 이루어진다.
Cystic fibrosis conductance transmembrane regulator (CFTR)의 regulatory (R) 지역 역시 다양한 표적 단백질들과 상호작용하여 CFTR의 활성도 조절 및 세포막으로의 이동에 중요한 역할을 한다 [29, 30]. R지역은 CFTR의 NBD(nucleotide binding domain)와 상호작용하여 helix form으로 folding되는데, 이는 NBD들 간 dimerization 및 channel의 열림을 저해한다. 그러나 R지역의 특정 아미노산들이 인산화 되면, helix의 안정성이 감소하게 되고, R지역은 NBD대신 CTFR의 C-terminus 혹은 chloride/bicarbonate exchanger인 SLC26A3의 STAS domain과 풀린 형태로 상호작용한다. 이로 인해 NBD 간 dimerization, ATP hydrolysis 및 channel의 열림이 이루어지게 되고, CFTR과 SLC26A3는 물리적으로 인접하게 되어 상호 활성화된다. 인산화 된 R지역은 14-3-3 단백질과도 상호작용하는데, 이는 CFTR이 소포체로부터 정상적인 세포 내 이동을 하는데 중요한 역할을 한다.
같은 아미노산 개수를 갖고 있는 IDR과 ordered globular domain을 비교하면, solvent에 노출되어 다른 표적 생체 고분자들과 상호작용할 수 있는 표면적의 비율이 자연히 IDR에서 월등히 높게 나타난다 [31]. 또한, ordered domain에 존재하는 결합 자리는 1차 구조상 다양한 위치에 있는 특정 아미노산들이 3차원 구조에 의해 인접함으로써 형성되는데 반해 IDR에 존재하는 결합 자리는 주로 1차 구조상에서 연속적인 아미노산들로 이루어진다(Short Linear Motif, SLiM) [32, 33]. 따라서, 긴 IDR들에는 다수의 결합 자리들이 존재할 확률이 높으며, 이들을 통해 다양한 표적 단백질들과 상호작용 할 수 있다. 이러한 다중 성분 복합체(multi-component complex)를 형성하는 성질로 인해 다양한 신호 전달 경로를 종합/처리하는 중추 단백질(central hub proteins)에 주로 긴 IDR들이 존재한다 [34]. 중추 단백질 중 하나인 Axin의 대부분(약 600 아미노산)은 IDR이며, 여기에 존재하는 다양한 결합 motif들은 Wnt, TGF, JNK, p53등의 신호 전달 경로에 관여하는 단백질들과 적절한 시간과 공간에서 상호작용하여 각 경로에 적합한 다중 성분 복합체를 형성한다 [35]. Wnt pathway의 경우, Axin의 IDR은 β-catenin, casein kinase Iα (CKIα), glycogen synthetase kinase 3β(GSK3β)와 동시에 결합하여 표적 단백질들 간 상호작용을 유도하는데, 이는 β-catenin의 CKIα, GSK3β에 의한 효율적인 인산화 그리고 분해로 이어진다 (β-catenin destruction complex). 즉, 중추 단백질들은 특정 반응에 참여하는 단백질들의 국지적 농도(local concentration)를 증가시켜 반응을 촉진시키는 scaffold 역할을 한다.
최근에는 다중 성분 복합체를 형성하는 IDR이 외부의 신호(생체 분자의 결합 혹은 post-translational modification)를 인지하고 복합체 내 결합 단백질들 간 소통을 매개함으로써 복합체의 전체적인 구조 및 기능을 조절한다는 흥미로운 가설이 제시되었다 [36, 37]. 즉, IDR내 다양한 결합 자리들 간 allosteric coupling이 존재한다는 것이다. 이 가설은 allosteric coupling은 두 결합 자리 간 정형화된 구조의 경로를 통해 이루어진다는 전통적인 개념과 괴리가 있으나, 열역학적 분석을 통해 IDR 내 두 결합 자리 사이에서도 allosteric coupling이 가능함을 입증하는 이론적 토대가 제시된 바 있다 [38]. 가장 간단한 two-domain model을 이용하여 이 이론의 핵심 전제와 결과를 논의하겠다 (그림 2). 전제1. 두 domain 모두 풀린(disordered) 혹은 정형화(ordered)된 상태로 존재하며, 표적 단백질과 비결합 시에는 풀린 상태의 자유 에너지(Gibbs free energy)가 더 낮아 ensemble내에서 우세한 비율을 차지한다. 전제2. 두 domain간 positive coupling이 존재하여, 동시에 같은 상태(풀린 혹은 정형화)로 존재할 확률이 혼합된 상태로 존재할 확률보다 높다. 전제3. 표적 단백질들은 각 domain의 정형화된 상태에 선택적으로 결합한다(coupled folding). 즉, 결합 상태에서는 정형화된 상태의 자유 에너지가 더 낮다. 전제1, 2에 의하여, 표적 단백질의 부재 시에는(그림2의 ensemble 1) 두 domain 모두 풀린 상태로 존재할 확률이 가장 높고(0.6), 모두 정형화된 상태(0.2) 그리고 혼합된 상태(0.1)의 차례로 존재한다. 첫 번째 표적 단백질이 해당 domain에 결합할 경우(ensemble 2 혹은 3), 전제2, 3에 의하여, 결합된 domain은 모두 정형화된 상태로 존재하고, positive coupling에 의해 다른 domain도 대부분 정형화된 상태로 변환되면서 존재 확률이 0.3에서 0.8로 증가한다. 따라서, 두 번째 표적 단백질은 해당 domain에 대하여 더 높은 (첫 번째 표적 단백질의 부재 시에 비하여) 결합력을 보인다 (K1' > K1 혹은 K2' > K2). 본 이론은 두 결합 자리 사이에 정형화된 경로가 존재하지 않더라도, 두 자리의 상대적인 안정성(stability)과 열역학적 연결성(coupling), 그리고 표적 단백질의 선택적 결합(preferential binding) 간의 세밀한 균형에 의해 allosteric coupling이 형성될 수 있음을 입증한다.
IDR에 의해 매개되는 allosteric coupling은 P1 bacteriophage의 toxin-antitoxin operon 조절에 관여하는 Doc1(toxin)과 Phd(antitoxin)의 상호작용 연구를 통해 최초로 관찰되었다 (그림 3) [39]. Phd의 N-terminal DNA binding domain은 정형화된 구조와 부분적으로 풀린 구조 간 평형 상태로 존재하며, C-terminal Doc1 binding domain은 완전히 풀린 구조(IDR)와 정형화된 구조 간 평형 상태로 존재한다. 두 domain 간 positive allosteric coupling으로 인해, Doc1의 결합 시 두 domain 모두 정형화된 구조로 평형 이동이 되고, 그 결과로 operator DNA와의 결합 그리고 operon의 repression이 이루어진다. Adenoviral oncoprotein E1A의 N-terminal IDR과 숙주 단백질 CBP 그리고 pRb 간 상호작용에서도 IDR에 존재하는 CBP와 pRb 결합자리들의 coupled folding에 의한 positive coupling이 존재하는데, 이 경우에는 특이하게 CBP와 부분적으로 결합하는 E1A의 N-terminal end가 제거되면 CBP와 pRb간 positive coupling이 negative coupling으로 전환된다 [40]. 이는 세포 내에 존재하는 CBP외의 다른 표적 단백질들의 N-terminal end 결합 유무에 따라 CBP와 pRb 간 연결 관계가 규정되고, 궁극적으로 E1A 복합체의 기능(숙주 세포 주기 파괴, 바이러스 유전자 발현의 활성화 등)이 조절될 수 있음을 암시한다. 핵-세포질 간 물질 이동을 관장하는 Nuclear Pore Complex (NPC)의 central transport channel에 존재하는 Nup58의 C-terminal IDR과 생체 고분자를 수송하는 karyopherin β1 (Kap β1) 간 상호작용에 대한 최근 연구는 Nup58의 IDR과 ordered domain 간 allosteric coupling을 입증하였다 (그림 4) [41]. Nup58의 C-terminal IDR과 Kap β1의 다가 결합(multivalent binding)에 의해 Nup58과 Nup54의 α-helix 지역들 간 상호작용이 촉진되는데 (positive coupling), 이를 바탕으로 핵-세포질 간 생체 고분자의 수송량에 따른 central channel의 구조 변화에 대한 통계 열역학적 모델이 제시되었다.
상기 논의된 연구들은 IDR-mediated allosteric coupling 개념을 지지하는 중요한 실험적 단서를 제공하지만 이에 대한 구체적 분자 기반을 제시하지 못한다. 앞서 살펴본 이론적 모델 역시 두 domain 간 coupling의 존재를 가정했을 뿐 (전제 2) 그 기전은 논의하지 않고 있다. 따라서 IDR-mediated allosteric coupling의 분자 기반을 이해하기 위한 다각도의 생물물리학적 연구가 필요하며, 이를 통해서만 IDR-mediated allosteric coupling이 갖는 고유의 특징(ordered domain에 비교하여)을 규명할 수 있다. 또한, 본 연구들은 상대적으로 환원된(IDR을 포함하는 20 kDa 미만의 혹은 절단된(truncated) 단백질과 두 개의 표적 단백질 간 결합) 모델 시스템을 이용하는 한계점이 있어 IDR-mediated allosteric coupling 개념을 일반화하기 위해서는 복잡하고 자연 상태에 가까운 시스템(full length or near intact systems)으로 확장된 후속 연구가 필요하다.
현재 연구의 한계에도 불구하고, IDR에 의한 다중 성분 복합체(multi-component macromolecular complexes) 내 allosteric coupling의 특수성을 추측할 수 있다. 첫째, IDR에 의해 형성된 다중 성분 복합체는 유사한 free energy를 갖는 다양한 형태들을 취할 수 있으며, 이러한 ensemble 내 형태들 간 activation energy barrier는 낮다(flat energy landscape). 둘째, 다중 성분 복합체는 IDR에 존재하는 다수의 결합 혹은 변형 자리들을 이용하여 다양한 외부 신호(표적 단백질의 결합 혹은 PTM)들을 인지할 수 있다. 셋째, 각 외부 신호는 특정 결합 단백질들과 해당 결합 자리들 간 상호작용을 조절하여 (allosteric facilitation or inhibition), 복합체의 ensemble을 특정 구성 및 형태로 이동시킬 수 있으며 이는 기능의 전환으로 이어진다. 이러한 전환은 복합체의 flat energy landscape으로 인해 호의적으로 그리고 빠르게 이루어진다. 즉, IDR에 의해 형성된 다중 성분 복합체는 정형화된 구조를 갖는 복합체에 비하여, 역동적으로 변화하는 외부 신호에 다양하고 신속하게 반응할 수 있는 잠재성을 갖고 있다.
지난 20년간의 연구를 통해, IDR대한 인식은 ordered domain간 수동적 linker 혹은 단백질 말단에서 세포 내 프로세스 전반에 관여하는 주요 조절 인자로 진화하였다. 이러한 인식의 전환은 다음 단계의 도전적인 질문들을 생성한다. Macromolecular crowding이 지배하는 세포 내에서 IDR은 어떠한 구조 상태로 존재할 것인가? 현재 연구 대상의 대부분을 이루는 isolated IDR과 전체 단백질(full length)의 context에서의 IDR이 같은 구조적 상태와 기능성을 나타낼 것인가? 그리고 앞서 언급한 것처럼 다중 성분 시스템에서 다양한 결합 파트너와 어떻게 상호작용하며, 어떻게 이들 간 소통을 조절할 것인가? 또한, 이번 논단에서는 다루지 않았지만, IDR에 의한 liquid-liquid phase separation(LLPS) 혹은 막이 없는 세포 소기관(proteinaceous membrane-less organelles, PMLO)의 형성은 다양한 생물학 분야에서 많은 관심을 받고 있다 [42]. 그러나 현재 연구는 LLPS, PLMO의 현상적인 관찰에 집중되어 있어, 이들의 형성 driving force및 mechanism, 그리고 그 기능성에 대한 이해는 초보적인 단계에 머물러있다. 더 근본적으로는 LLPS의 기반을 이루는 IDR-IDR 혹은 IDR-표적 단백질들 간 다가 상호작용(multivalent interaction)에 대한 이해가 부족하다. 따라서 다가 상호작용에서 기인하는 다양한 결합 모드의 열역학적/동역학적 모델링 및 이들에 대한 관찰, 분석 방법의 개발이 선행 되어야 한다. 궁극적으로, IDR에 대한 다방면의 통합적인 연구들은 생체 고분자 간 상호작용 및 그에 의한 생체 현상 조절에 대한 전반적인 이해가 더 확장되고 깊어지는 기회를 제공할 것이다.
서울대학교 생명과학부, 학사
University of Wisconsin-Madison, Ph.D.
Rockefeller University, Postdoctoral associate
서울대학교 생명과학부, 조교수
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