4개의 알파벳으로 이루어진 1차원 DNA 염기서열로부터 움직이고, 관찰하고, 생각하고, 판단할 수 있는 3차원 유기체가 어떻게 만들어 질 수 있는가는 지난 백여 년간 자연과학의 주요 주제였다. 유기체의 구성을 보면, 우선 나노 스케일 생체분자들이 모여 마이크로 스케일의 세포를 이루고, 이 세포들이 모여 조직과 기관을 만들게 된다. 이 때 어느 스케일을 보더라도 구성 요소들이 무작위적으로 분포하는 것이 아니라 각 요소 간 긴밀한 물리화학적 상호작용을 통해 규칙성을 갖는 구조를 이룬다. 열에너지에 의해 생체 분자의 무작위적 움직임(brownian motion)이 발생함에도 불구하고 생체시스템이 규칙적(ordered)이고 강건한(robust) 구조를 이루는 것은 실로 놀라운 일이다.
세포도 생체분자들의 물리화학적 상호작용의 종합적 결과물이다. 세포 안팎을 구분하는 세포막 자체도 양친성(amphiphilic) 인지질 분자가 물에서 자기조립(self-assembly)하는 기작에 의해 유지된다. 세포 내부를 보면 인지질의 자기조립을 통해 형성된 다양한 소기관(organelle)들이 구획화(compartmentalization)하고 있다. 세포는 구획화를 통해 세포 활동에 필요한 수 많은 생화학 반응이 효과적으로 일어나게 한다. 흥미롭게도 세포는 막으로 쌓여 있지 않는 소기관(membrane-less organelle)들도 다양하게 가지고 있다. 가장 대표적인 예인 핵소체(nucleolus)는 이미 19세기 중반에 처음 기록되었다. 핵소체 외에도 paraspeckle, nuclear speckle, Cajal body, PML body 등의 다양한 막이 없는 소기관이 핵 내에 존재하고, 세포질에도 stress granule, germ granule, P-body 등이 존재한다. 막이 없음에도 불구하고 특정 생체분자들이 국소적으로 모여 있고, 동시에 이 생체분자들이 소기관 안팎을 어느 정도 자유롭게 움직인다는 점에서 막이 없는 소기관들은 물리적관점으로 볼 때 대단히 흥미로운 구조이다.
 막이 없는 소기관의 생성 기작(biogenesis mechanism)은 오랜 시간 명확하지 않았다. 그런 가운데 2009년 Max Planck 연구소의 Anthony Hyman 연구실에서 박사후 연구원으로 있던 Clifford Brangwynne이 예쁜꼬마선충(C. elegans) 배아세포의 P granule이 액체방울의 물리적 특성을 갖음을 보여 Science지에 보고하였다[1]. 예쁜꼬마선충 배아는 1세포기에서 세포 분열을 할 때, 특정 단백질과 RNA들이 국소적으로 모여 있는 P granule를 두 딸세포 중 한 세포로만 전달한다. Brangwynne은 1세포기부터 P granule이 세포 분열을 통해 분리(segregation) 전달되는 과정을 정량 분석한 결과, 세포질에 균일하게 분포하는 P granule이 단순히 세포 한쪽으로 이동하는 것이 아니라 하나의 세포질 내에서 불균일하게 응결 및 분해됨을 밝혔다. 또한 두 개의 P granule이 합쳐져 하나가 되고, 세포질 내 유체의 흐름에 의해 granule 모양이 변형되고, granule 내 분자들이 세포질과 빠르게 교환되는 현상을 관찰하였다. 이러한 거동은 모두 P granule이 액체상(liquid phase)임을 시사한다. 이어진 연구에서 아프리카발톱개구리(Xenopus laevis) oocyte에 존재하는 nucleoli도 유사한 액체상의 거동을 보임이 보고되었다[2]. 이 연구에서 nucleoli가 구의 형상을 가지고 있고, 두 nucleoli가 만나서 하나가 될 때, 형상이 땅콩 모양에서 구 형태로 천천히 변화(shape relaxation)하는 것이 관찰되었다. 액체 물방울은 주어진 부피에서 표면에너지를 최소화하고자 구의 형태를 띄고, 표면장력에 의해 구가 아닌 형상은 구의 형태로 시간에 따라 변형되게 된다. 세포 내에 액체상 구조의 존재는 액체-액체 상분리(liquid-liquid phase separation)가 이러한 막이 없는 소기관의 생성 기작임을 시사한다[3,4].
 최근 5년여 간 세포 신호 전달, 신경 시냅스, 유전자 발현, 단백질 분해 등의 다양한 세포 구조 및 활동에 상분리가 주요한 역할을 함이 폭발적으로 보고되며 하나의 새로운 연구 분야로 떠오르고 있다. 또한 세포 내 생체분자들이 응집되어 존재하는 모든 구조를 통칭하고자 condensate(응집체)이라는 용어가 소개되어 많이 사용되고 있다[4].

상분리의 생물리적 원리

 일상 생활에서 경험하는 물과 기름이 서로 분리되어 두 액체상으로 공존하는 현상이 상분리이다. 이는 시스템이 열역학적 자유에너지를 최소화하는 과정에서 발생하는 결과이다. 시스템의 자유에너지는 엔트로피와 엔탈피로 구성되며, 분자 간 상호작용이 엔탈피의 주요 요소이다. A와 B 두 분자로 이루어진 시스템을 생각해 볼 때, 만약 A-A 간의 상호작용이 A-B, B-B 상호작용과 모두 유사한 정도라면 시스템 내 A와 B는 엔트로피를 최대화(자유에너지는 최소화) 하고자 잘 섞여 있게 된다. 하지만 만약 같은 종류의 분자끼리의 상호작용이 다른 종류 사이의 상호작용보다 더 강하다면, 시스템은 A 분자가 많은 영역과 B 분자가 많은 영역으로 공간을 나눔으로써 전체 자유에너지를 낮출 수 있게 된다[3].
 상분리에 의해 분자별 농도가 상이한 두 영역이 공간 상에 생성될 때, 조성(composition, 각 분자별 농도)이 다른 두 상(phase)이 공존한다고 표현한다. 이 때 각 상의 조성은 상을 이루는 분자 간의 상호작용에 의해 결정된다. 예를 들어, 상분리 하는 단백질을 용질(solute)로 하고, 물과 이온으로 구성된 버퍼를 용매(solvent)로 하는 용액 시스템을 생각하면, 시스템이 상분리를 할 때 단백질의 농도가 높은 condensed phase과 농도가 낮은 dilute phase가 생성된다. 이 때 두 상의 단백질 농도는 단백질 간 상호작용 정도와 단백질과 용매 사이의 상호작용, 용매 분자 간의 상호작용 정도에 따라 복합적으로 정의되며 시스템의 특성이라고 할 수 있다. 단백질 농도가 포화농도(saturation concentration)보다 낮을 때에는 상분리가 일어나지 않는다. 포화농도는 단백질 별로 상이하며 온도나 이온 농도와 같은 외부 변수에 따라 변화하는 값이다. 초기 단백질의 농도가 포화농도 보다 높을 때 상분리가 발생하게 되고, 이 때 dilute phase의 농도가 포화농도와 동일해질 때까지 condensed phase의 부피가 늘어나게 된다. 하나의 정제된 단백질로 이루어진 in-vitro 실험에서 이러한 거동이 여러 단백질에 걸쳐 실제로 관찰되었다[3,4]. 상분리 거동을 종합적으로 볼 때, 단백질 농도를 x축, 온도나 이온 농도와 같이 상분리에 영향을 줄 수 있는 변수를 y축으로 하여, 어떤 조건에서 시스템이 상분리 할지를 한 눈에 표현하는 상평형 그림(phase diagram)을 실험적으로 구하기도 한다.

상분리를 일으키는 생체분자의 특성

 상분리를 일으키는 생체분자들은 분자 간 약한 다가성 상호작용(transient/weak multivalent interaction)을 한다는 점이 공통적으로 밝혀졌다[3]. 이러한 특성을 갖는 대표적인 단백질이 약하게 결합하는 도메인들이 여러 개 연결된 형태의 다가성 단백질(multivalent protein)이다. Michael Rosen 연구실에서 2012년 Nature지에 인공적으로 제작한 다가성 단백질이 상분리 함을 보고하였다[5]. 신호전달 단백질에서 많이 발견되고 서로 약하게 결합하는 PRM(proline-rich motif), SH3(SRC homology 3) 도메인이 4개 연결된 PRM₄, SH3₄ 단백질을 제작하여 두 단백질의 농도에 따라 액체 방울 형태의 상분리 응집체가 만들어짐을 보이고, 상평형 그림을 측정하였다. 다가성 단백질의 경우, 도메인 간의 약한 상호작용(PRM₁-SH3₁의 경우 K_d = 350µM)이 여러 도메인에 걸쳐 발생하면서 응집체 내 분자 간 동적 연결성을 매개하는 것으로 보인다. 실제로 다가성 단백질의 결합가(valency)가 포화농도와 상평형 그림의 모양에 영향을 줌이 밝혀졌다.
 약한 다가성 상호작용을 일으키는 또 다른 모티프로는 무정형 영역(intrinsically disordered regions/proteins)이 있다. 잘 정의된 삼차원 구조를 갖는 단백질과 달리 무정형 단백질은 제한된 아미노산이 사용되는 경향(low complexity sequence)이 있고, 단백질의 형상(conformation)이 유연하게 변화하는 성질이 있다. 여러 연구에서 무정형 단백질이 in-vitro와 세포 내에서 상분리 함을 보였다[3,4]. 이 중 프리온과 유사한 아미노산 서열을 갖는 단백질(prion-like domain)들은 액상 응집체가 시간이 지남에 따라 고체화하는 현상이 관찰되어, 퇴행성 신경질환과 관련하여 학계의 많은 주목을 받았다. 무정형 단백질의 경우도 폴리펩타이드 사슬을 따라 약한 다가성 상호작용을 매개하는 주요 아미노산들이 조금씩 밝혀지고 있다. 전하를 띄고 있는 아미노산 간의 정전기적 상호작용, 방향족 아미노산과 염기성 아미노산 사이의 cation-pi 상호작용 등이 상분리에 중요한 역할을 함이 보고되었다.

세포 내 상분리의 조절

 이론적으로 볼 때, 상분리는 분자 간 상호작용에 의한 결과이므로 상분리를 일으키는 분자의 농도와 상호작용의 세기가 조절되면 상분리가 조절될 수 있다. 실제로 세포의 다양한 활동에 의해 상분리 응집체의 형성이 조절됨이 밝혀지고 있다. 막이 없는 소기관 중에는 RNA와 RNA 결합 단백질이 응집되어 구성된 예들이 많고 이들을 RNP granules 라고도 한다. 많은 RNA 결합 단백질들이 무정형 영역과 함께 RNA recognition motif(RRM)과 같은 도메인으로 구성되어 있다. 정제된 단백질을 이용한 in vitro 실험에서 FUS, hnRNPA1, TDP43, G3BP, FIB1 등의 RNA 결합 단백질들이 상분리 함이 밝혀졌다[6]. 많은 경우 RNA 결합 단백질의 무정형 영역만으로도 상분리가 관찰되었으나, full-length 단백질의 경우 RNA에 의해 상분리가 촉진되는 양상을 보였다. 즉, RNA의 존재가 RNA 결합 단백질의 포화 농도를 낮추어, 더 낮은 단백질 농도에서도 상분리가 관찰되었다. 무정형 영역 간의 상호작용과 더불어 RNA와 RNA 결합 도메인 간의 상호작용이 다가성 상호작용을 일으켜 상분리를 촉진하는 것으로 보인다.
 이러한 in-vitro 데이터는 세포 내에서 RNA에 의해 상분리가 조절될 수 있음을 시사한다. 실제로 이미 10여년 전 특정 RNA을 유전체에 국소적으로 농축시키거나 또는 원래 자리가 아닌 위치에서 발현시켰을 때(ectopic expression), 해당 RNA와 연관된 paraspeckles, histone locus bodies, Cajal bodies 등이 de-novo로 형성되는 것이 관찰되었다[7]. 또한 nucleoli가 전사가 활성화된 rDNA 유전좌(genomic loci)에서 선택적으로 성장함이 보고되었다[8]. 앞서 언급한 예쁜꼬마선충 배아의 p granule 분리 과정에서 mRNA에 대한 MEX-5와 PGL-3 단백질의 결합력(affinity) 차이에 의해 PGL-3 단백질이 주도하는 p granule의 비대칭적 상분리가 조절된다는 기작이 보고되기도 하였다[9].
 단백질은 생성된 후 다양한 종류의 번역후변형(post-translational modification)을 거친다. 아미노산의 화학적 변화는 단백질 간 상호작용을 변화시키기 때문에, 상분리 연구 초기부터 번역후변형에 의한 상분리 조절 기작이 많이 연구되었다. 최근 연구에서 DYRK3 인산화효소(kinase)가 nuclear speckle를 포함한 다양한 상분리 응집체의 단백질들을 세포 분열 과정에서 인산화(phosphorylation)하여 분해(dissolve)한다는 것이 밝혀졌다[10]. DYRK3의 이러한 작용은 딸세포로 응집체가 균일하게 전달되는데 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 인산화된 타이로신과 SH2 도메인과의 결합과 같이 번역후변형이 단백질 간 상호작용에 중요한 경우에는 인산화가 상분리를 유도하기도 한다[11]. 이외에도 PML 단백질의 수모화(sumoylation) 정도가 SUMO-SIM 다가성 상호작용을 통한 PML body의 생성에 중요하다고 알려져 있으며, DNA 손상 반응에서 polyADP-ribosylation (PARylation)이 손상된 유전좌에서의 액상 상분리 응집체의 응결을 유도함이 밝혀졌다[12].

상분리의 생물학적 기능

 세포 내 상분리가 어떤 생물학적 기능을 수행하는지는 응집체 생성의 분자 기작에 대한 연구보다 상대적으로 적게 이루어져 왔고, 향후 집중적 연구가 더 필요한 주제이다. 상분리 응집체는 특정 생체분자를 국소적으로 농축시키는 동시에 세포막과 같은 물리적 경계로 닫혀 있지 않은 ‘열린’ 구조라는 점이 특징적이다. 이러한 특징은 세포 내부 구획화를 통해 특정 세포반응을 촉진하는데 주요한 역할을 하는 것으로 보인다. 실제로 RNA 효소(ribozyme)가 in-vitro 응집체 내에 농축되었을 때, 반응속도가 70배 정도 빨라지는 것이 관찰되었다[13]. 또한 SH3/PRM과 인산화 타이로신/SH2로 이루어진 상분리 시스템이 in-vitro와 세포 내에서 액틴 필라멘트 생성과 신호 전달을 촉진한다는 보고가 있었다[11]. 나아가 이러한 생화학반응 속도 증가가 단순히 농도의 증가에 의한 것이 아니라 응집체 내부 분자의 specific activity를 높여 작동하는 기작이 밝혀졌다[14].
 응집체는 특정 생체분자들을 격리시킴으로써 응집체 외부에 영향을 주기도 한다. 스트레스 상황에서 세포질에 생성되는 stress granule이 번역이 중단된 mRNA 복합체를 모은다는 점은 잘 알려져 있다. 하지만 상분리 응집체 밖에도 포화농도 수준의 분자가 존재한다는 점에서 격리의 기능성에 대해서는 보다 정량적인 분석이 필요하다. 최근에는 핵내에 존재하는 비활성화된 염색질이 응축되어 만들어지는 이질염색질(heterochromatin)이 상분리를 통해 형성된 액체상의 물리적 특성을 갖고 있다는 보고도 있었다[15]. 이질염색질의 경우도 전사가 이루어지지 않는 염색질을 전사인자 등의 접근으로부터 격리시키는 작용으로 볼 수 있다.    
 지난 수 년에 걸쳐 상분리에 의한 세포 내 활동 및 구조의 예는 지속적으로 늘고 있는데, 그 중 응집체가 세포 내 다른 구조들을 조직화하는 경우들도 있다. 신경 세포의 시냅스 전과 후에서 응집체들이 생성되어 시냅스 소포(synaptic vesicle)나 신호전달과 관련된 단백질들을 모으는 기능을 함이 보고되었다[16]. 또한 유전자 발현 및 유전체의 3차원 구조와 관련하여 상분리가 최근 많은 관심을 받고 있다. 넓은 유전체 영역에 걸쳐 분포하는 인핸서(super enhancer 또는 stretch enhancer)에 RNA 중합효소(RNA polymerase II)와 Mediator, 전사인자들이 응집체를 형성한다는 보고가 있었다[17]. 나아가 유전체의 3차원 구조에서 발견되는 활성/비활성 compartmentalization (A/B compartments)에 상분리가 관여한다는 모델과 실험증거들이 나오며 활발히 연구되고 있다.

결언

 세포는 구조와 기능이 서로 맞물려 작용하는 자기조직화 시스템(self-organized system)이다. DNA의 염기서열에 저장되어 있는 1차원 정보로부터 물리화학적 특성을 갖는 생체 분자들이 생성되고, 이 생체분자들이 스스로 구조를 만들고 기능하여 자기조직화를 이룬다. 물과 기름을 두 액체로 분리시키는 물리적 원리가 세포에 작용하여 그 내부를 구획화하고 다양한 세포 활동의 수행을 돕는다. 세포 내 상분리 연구가 본격적으로 시작된지 이제 5년여 정도가 지났고, 단순하면서도 복잡다단한 상분리 현상이 어떤 분자적 기작을 통해 발생하고 조절되며, 이러한 과정에 이상이 생겼을 때 어떻게 질병을 초래하는지 조금씩 밝혀지고 있다. 응집체의 물리적 특성이 응집체 내 분자의 움직임이나 활성도 등에 변화를 주어 궁극적으로 응집체 기능에 영향을 줄 수 있기 때문에, 생물리학을 포함한 다양한 접근법이 융합될 때 좋은 연구 결과가 나올 것으로 기대된다. 또한 이러한 응집체의 생성과 특성을 제어할 수 있는 기술들은 응집체의 기능과 조절 기작을 밝히는데 유용하게 활용될 것으로 보인다.

참고문헌

• [1]

  C. P. Brangwynne et al. (2009), Germline P granules are liquid droplets that localize by controlled dissolution/condensation. Science 324, 1729–1732.

• [2]

  C. P. Brangwynne, T. J. Mitchison, A. A. Hyman (2011), Active liquid-like behavior of nucleoli determines their size and shape in Xenopus laevis oocytes. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 108, 4334–4339.

• [3]

  Shin, Y. & Brangwynne, C. P. (2017) Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science 357, eaaf4382

• [4]

  Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A. & Rosen, M. K. (2017) Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 285–298.

• [5]

  P. Li et al., (2012) Phase transitions in the assembly of multivalent signalling proteins. Nature 483, 336–340.

• [6]

  Lin, Y., Protter, D. S., Rosen, M. K., & Parker, R. (2015). Formation and maturation of phase-separated liquid droplets by RNA-binding proteins. Molecular cell, 60(2), 208-219.

• [7]

  Y. S. Mao, H. Sunwoo, B. Zhang, D. L. Spector, (2011) Direct visualization of the co-transcriptional assembly of a nuclear body by noncoding RNAs. Nat. Cell Biol. 13,95–101

• [8]

  J. Berry, S. C. Weber, N. Vaidya, M. Haataja, C. P. Brangwynne, (2015) RNA transcription modulates phase transition-driven nuclear body assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, E5237–E5245

• [9]

  Saha, S., Weber, C. A., Nousch, M., Adame-Arana, O., Hoege, C., Hein, M. Y., ... & Pozniakovski, A. (2016). Polar positioning of phase-separated liquid compartments in cells regulated by an mRNA competition mechanism. Cell, 166(6), 1572-1584.

• [10]

  Rai, A. K., Chen, J. X., Selbach, M., & Pelkmans, L. (2018). Kinase-controlled phase transition of membraneless organelles in mitosis. Nature, 559(7713), 211-216.

• [11

  Su, X., Ditlev, J. A., Hui, E., Xing, W., Banjade, S., Okrut, J., ... & Vale, R. D. (2016). Phase separation of signaling molecules promotes T cell receptor signal transduction. Science, 352(6285), 595-599.

• [12]

  Altmeyer, M., Neelsen, K. J., Teloni, F., Pozdnyakova, I., Pellegrino, S., Grøfte, M., ... & Lukas, J. (2015). Liquid demixing of intrinsically disordered proteins is seeded by poly (ADP-ribose). Nature communications, 6(1), 1-12.

• [13]

  Strulson, C. A., Molden, R. C., Keating, C. D., & Bevilacqua, P. C. (2012). RNA catalysis through compartmentalization. Nature chemistry, 4(11), 941-946.

• [14]

  Case, L. B., Zhang, X., Ditlev, J. A., & Rosen, M. K. (2019). Stoichiometry controls activity of phase-separated clusters of actin signaling proteins. Science, 363(6431), 1093-1097.

• [15]

  Strom, A. R., Emelyanov, A. V., Mir, M., Fyodorov, D. V., Darzacq, X., & Karpen, G. H. (2017). Phase separation drives heterochromatin domain formation. Nature, 547(7662), 241-245.

• [16]

  Zeng, M., Shang, Y., Araki, Y., Guo, T., Huganir, R. L., & Zhang, M. (2016). Phase transition in postsynaptic densities underlies formation of synaptic complexes and synaptic plasticity. Cell, 166(5), 1163-1175.

• [17]

  Sabari, B. R., Dall’Agnese, A., Boija, A., Klein, I. A., Coffey, E. L., Shrinivas, K., ... & Li, C. H. (2018). Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science, 361(6400).

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