| EST, Microarray, and Plant Science이 상 협 / 박사 생명공학연구소, 연구원 Tel. 042-860-4466 Fax. 042-860-4608 E-mail. sanghyeobl@yahoo.co.kr 최근 들어 급속히 발달된 DNA sequencing technology와 이를 바탕으로 한 대량의 유전자 서열 분석 기법의 확립은 기존의 분자 생물학적 실험에 지대한 영향을 미쳤다. 따라서 genetic이나 reverse-genetic을 이용해서 한두개의 유전자의 기능을 밝히는 기존의 방식으로는 대량으로 쏟아지는 유전자 정보를 처리할 수 없는 한계 상황에 처했다. 따라서 이를 극복할 새로운 방법들이 개발되고 있고 그 중 가장 강력한 방법이 microarray technology이다. Genomics 현재 두 종의 식물체, 애기장대 (Arabidopsis thaliana), 벼 (Oryza sativa)에서 전체 염기서열이 밝혀졌다 (Arabidopsis Genome Initiative, 2000). 이러한 전체 지놈의 염기서열 확보는 식물체 한 개체에 대한 systemic한 분석을 가능케 해 주리라 예측된다. 즉 확보된 염기서열을 바탕으로 유전자 부분을 예측해 낼 수 있으며 전체 유전자에 대한 기능 분석 및 이들 유전자들의 상호 관계 분석을 통해 생명현상에 대한 이해의 폭을 넓힐 것이다. 그러나 우리가 연구 대상으로 하는 모든 식물체를 대상으로 전체 염기서열을 시행하기에는 상당한 비용이 필요하다. 따라서 대안으로 부상하는 것이 EST (Expressed Sequence Tag)이다. EST란 말 그대로 발현되는 유전자 단편이다. 이러한 EST는 특정 조직이나 환경 조건에서 발현되는 mRNA를 역전사 (Reverse Transcription) 반응을 통해 생성된 cDNA를 5′- 이나 3′- end 부분을 염기서열함으로써 생성된다 (Boguski and Schuler, 1995). 그러므로 EST는 샘플링할 때에 발현되는 유전자에 대한 snapshot만 제공할 뿐이고, intron이나 regulatory DNA에 대한 정보는 제공하지 못한다 (Lee, S. P. and Lee, K. H. 2000). 그럼에도 불구하고 확보의 용이성 때문에 cDNA library의 증가와 더불어 EST의 수가 기하급수적으로 늘고 있다. 2000년 12월을 기준으로 dbEST (http://www. ncbi.nlm.nih.gov/ dbEST/)를 보면 6,200,000개 이상의 의 EST가 저장되어 있다. 이 중 식물체가 102종이며 대표적인 종은 Glycine max, Arabidopsis thaliana, Lycopersicon esculentum, Zea mays, Oryza sativa, Sorghum bicolor, Triticum aestivum, Solanum tuberosum 등이다 (Quackenbush, J. et al., 2001). 애기장대의 경우를 보면, 105,733개의 redundancy를 포함한 EST가 전체 25,498개의 유전자 중 60%를 나타내는 것으로 밝혀졌다 (Arabidopsis Genome Initiative, 2000). 현재 국내에서도 배추, 인삼, 고추를 중심으로 EST를 확보하는 작업이 활발히 진행 중이다. Functional genomics 대량으로 쏟아지는 유전자의 기능을 기존의 형질전환체 방법을 이용해서 밝히는 것이 거의 불가능해졌다. 따라서 대량으로 유전자 기능을 밝히는 작업이 tagging line을 이용해서 시도되어져 왔으나 식물체 자체가 갖고 있는 유전자의 기능적 중복 (functional redundancy)성 때문에 크게 성공을 거두지 못하는 실정이다. 따라서 이에 대한 대안으로 바이러스를 이용한 gene silencing (Virus Induced Gene Silencing)을 이용하는 것이 시도되고 있다 (Dalmay et al., 2000). 이 방법의 장점은 sense 와 antisense 상관없이 80% 이상의 sequence identity를 가지면 gene family member일지라도 동시에 각 family member 유전자의 발현을 억제한다. 따라서 식물체처럼 다량의 gene family가 존재하는 system에서는 아주 유용한 방법이다. 그러나 이런 이점에도 불구하고 담배 (Nicotiana bentamia 에서만 효율적으로 작용) 외에는 아직 효과적으로 이용되지는 못하고 있다. 따라서 대안으로 유전자 발현양상 분석 (gene expression pofiling), 아미노산 서열 상동성 분석(sequence analysis), 비교 유전체 분석 (comparative genomics or synteny) 등의 상당히 다양한 computation한 방법을 이용해서 기능을 유추하는 시도가 진행되고 있다. 유전자 발현양상 분석 mRNA 수준에서의 유전자 발현을 분석하는 방법은 여러 가지가 있으며 크게 Northen-blot (Alwine et al., 1977), differential display (Liang and Pardee, 1992), dotblot analysis (Lennon and Lehrach, 1991), Serial analysis of gene expression (SAGE; Velculescu et al., 1995) 등으로 나누어진다 (Table 1). 위에서 언급한 기존의 분석법으로는 대량의 유전자를 동시에 분석하기에 기술적인 한계가 있었다. 따라서 이를 가능케할 방법으로 DNA microarray technology가 새롭게 대두되었다 (Schena et al., 1995, Watson et al., 1998, Duggan et al., 1999). Microarray를 immobolized target sequence에 따라 DNA fragement based microarray (Schena et al., 1995) 와 oligonucleotide based microarray (Lipshutz et al., 1999)로 크게 나누어 볼 수 있다. Oligonucleotide based micrarrayer는 아주 짧은 oligomer (20-25mer)를 사용하므로 single nucleotide mismatch에 굉장히 sensitive하므로 genotyping 등에 적합하다. 그리고 oligo chip을 제작하기 위해서는 정확한 sequenec data가 필수적이다. 이에 반해 DNA fragment based microarray는 sequence information이 필수적이진 않다. 따라서 전반적으로 sequence information이 부족한 식물체를 대상으로 유전자 발현을 분석할 때에는 DNA chip이 유리하다. 따라서 여기에서는 주로 cDNA microarray에 대해 언급할 것이다. Microarray에 대한 기술적인 측면 (제작방법과 사용법), commercial supplier, instruments에 대한 자세한 내용은 다음 논문을 참조하면 유용한 정보를 얻을 수 있다 (Lemieux et al., 1998; Eisen and Brown 1999; Marshall 1998). DNA microarray Microarray는 유리 slided 위에 DNA 조각을 기계를 이용해서 아주 조밀하게 spotting함으로써 제작되어진다 (Fig. 1). DNA 조각의 source는 대개 genome sequencing 결과로 나온 EST clones, anonymous cDNA clones, genomic clones, DNA amplified from open reading frames (ORF) 등인데 각기 필요로 하는 실험 목적에 따라 정해진다. 현재의 기술적인 수준으로는 10,000 spots/3.24 cm2까지 spotting이 가능함으로 보통 glass slide (1X3 inch)에 20,000~25,000 개 유전자를 심을 수 있다 (Kehoe et al., 1999). Microarray는 제작 시 spotting하는 방법에 따라 통상적으로 Pin?방식과 Ink-jet?방식으로 나뉜다. Pin?방식은 multiple pin에 DNA를 묻혀서 solid한 slide 표면에 직접적으로 spotting하는 방법이고, Ink-jet?방식은 pizoelectric이나 solenoid valve를 이용해 분사해서 slide 표면에 DNA를 부착시킨다 (van Hal et al., 2000). 현재 \\Ink-jet\\방식의 기술적인 한계로 \\Pin\\방식이 주로 사용되어지고 있으며 이를 응용한 Affemetrix사의 \\Pin and ring\\방식은 우수한 spot 재현성을 보여주고 있다. Microarra 제작 시 DNA가 직접 부착되어지는 glass slide 표면은 DNA와의 결합을 쉽게하기 위해서 화학적으로 처리되어지는데 주로 poly-L-lysine, amine, aldhyde 등이 이용된다 (Schena et al., 1995; Schena et al., 1996; Rogers et al., 1999). 이렇게 positively 처리된 glass의 표면과 negatively charged DNA 조각은 쉽게 결합을 형성한다. 이외에도 slided 표면을 polyacrylamide gel pad, nylon membrane, nitrocellulose, other polymer를 이용해 coating 하려는 노력이 행해지고 있다 (Prounikov et al., 1998). 이렇게 제작된 microarray는 형광 dye (주로 Cy3와 Cy5 이용)로 염색된 mRMA 유래의 probe으로 hybridization된다 (Fig 1). 이후 microarray를 washing 한 후 scanner에서 각기 적합한 파장의 laser에서 발광을 시킨 후 각 spot에서 나오는 형광의 세기를 포착한다 (Fig. 1). 여기에서 detect 되는 signal의 세기는 각 spot의 실제적인 mRNA의 발현량과 정량적으로 비례를 한다. 이러한 형광 dye 감지법은 감도가 뛰어나 기술적으로 500,000 중의 한 개의 mRNA transcript까지 감지할 수 있다고 한다 (Schena et al., 1996). 또한 다른 excitation과 emission 파장을 가진 형광 dye를 사용함으로 두 sample (생리적이나 유전적으로 다른 mRNA populations) 간의 비교가 용이하다. 실제적으로 microarray 실험 시 두 개의 다른 dye로 labeling된 probe를 함께 섞어서 하나의 microarray에다 hybridization을 함으로 hybridization 과정에서 발생할 수 있는 실험적인 오차를 줄일 수 있는 이점이 있다 (Fig 1). 형광 dye의 여러 장점에도 불구하고 photobleaching이라는 단점이 여러 가지 문제점을 야기해서 data의 분석을 어렵게 하고 있다. 실례로 Fig. 2에서 보듯이 Cy5 dye가 Cy3 dye보다 전반적으로 강한 background intensity를 보이고 photobleaching에 더 민감하게 반응한다. 따라서 실제로 data를 분석할 때는 이런 현상을 감안하여 data를 보정해 주어야 하는데 이를 normalization이라고 하며 여러 가지 방법을 통해 이루어진다 (Alon et al., 1999; Eisen et al., 1998; Schena et al., 1996). 실험적으로는 dye swapping 이라고 해서 동일한 실험을 두 번 반복하는데 이 때 각 형광 dye를 서로 바꾸어서 실험해서 나온 데이터를 비교함으로써 data의 quality를 높이는 방법이 시행되고 있다. Characteristics of mcroarray data sets Microarray data의 한 가지 특이점은 많은 동일한 microarray로부터 얻어지기 때문에 여러 실험자 간에 데이터를 공유할 수 있다. 그러므로 stanford microarray database (SMD;http://afgc.stanford.edu/afgc_html/SMDguide/SMD.html) 같은 centralized databases를 만들면 여러 실험자가 data-mining을 통해 자기들이 원하는 특징적인 발현 패턴을 보이는 유전자 무리를 추출할 수도 있다. 이처럼 parallel 분석이 가능한 microarray data는 굉장히 powerful한 정보를 제공하지만 이 때문에 microarray 실험 시 주의해야 할 여러 요인 (Fig 3)들이 있는데 그 중 중요한 점을 살펴보면 아래와 같다. (1) 각 스텝마다 quality control이 필요하다. (2) 실험 시 replication이 필요하다. (3) 한 개의 microarray에 duplicate해서 DNA를 spotting 하는 것이 바람직하다 (4) 표준화된 protocol (재료 준비, labeling, hybridization, washing process)을 따라서 한다. 이렇게 표준화된 실험을 통해 생산된 data들도 서로 비교 분석하기 위해서는 표준화된 방식을 따라서 database를 구축해야 한다. 현재 data 표준화 방식이 추진중인데 조만간 발표될 예정이고, 어느 정도 최소한의 표준화 방안은 공개되어 있으며 MIAM (Minimum Information About A Microarray Experiment)로 불린다 (http://www. cbil.upenn.edu/Ontology/MIAME_MAML. htm; Kolchanov et al., 1999; Stoeckert et al., 2001). Microarray 실험은 지금까지 생물학자들이 접해보지 못한 방대한 data를 생산해내고 있고 현재의 통계학적 분석 능력이 이를 따라가지 못하고 있어서 bottleneck 현상을 야기하고 있다 (Ermolaeva et al., 1998). 이런 Bottleneck 현상은 DNA sequencing 분야에서도 경험한 것으로 DNA sequences가 database에 축척되기 시작한 후 약 15년 이후가 지나서야 blast 같은 염기 서열 분석 software가 routine하게 사용되고 있다 (Xiang and Chen, 2000). 이런 경험에 비추어 비약적인 기술의 발전에도 불구하고 상당한 시간이 지나야 detail학 interactive한 분석이 가능해지리라 여겨진다. Bioinformatics in cDNA microarray 현재 bioinformatics technology의 급격한 발달에도 불구하고 유전자 발현의 parallel 분석이 쉽사리 이루어지지는 않고 있다. 그러나 제한된 범위에서 상용화된 분석 tool이 여러 개 시판되고 있으나 현재 많은 보완이 필요하다. 특히 laboratory information management, image analysis, expression pattern recognition, comparison of larger number of different experimental samples, statistical analysis, visualization, construction of database 등에 관해서 많은 발전이 필요하다 (Xiang and Chen., 2000). LIMS (Laboratory Information Management System) 는 experomental material 정보의 흐름을 관리하는 system으로 microarray에 관한 전반적인 정보를 포함하고 있다 (Ermolaeva et al., 1998). 실례로서 ArrayDB (http://www. nhgri.nih.gov/DIR/LCG/15K/HTML/)를 보면 microarray와 cDNA clone (clone ID, title, database hyperlink)에 관한 정보, probe 정보 (sample source, experiment condition, flour type), image information (raw scanned image, intensity and ratio for each target clone) 등을 포함하고 있다. Microarra image analysis는 각 cDNA target location을 인지하고 각 probe의 intensity 와 ratio를 산출해서 clone information과 link시켜서 실험자가 모든 통합된 정보를 쉽게 알 수 있게 한다. 그러나 실제적으로는 printing한 pin type, hybridization 방법, analysis software의 상이성 때문에 각각의 분석 방법은 매우 다르다 (Bowtell, 1999; Chen et al., 1997). Gene expression analysis 분석은 현재 여러 통계적 방법을 이용하는데 대표적으로 사용되는 것이 hierarchical clustering, k-mean-based anlysis, self organized map (SOM), principle component analysis (PCA) 등이다 (Eisen et al., 1998; Sherlock 2000). 현재 사용되어지는 대표적인 분석 방법은 clustering analysis라고 해서 Co-regulation되는 유전자를 발견하는 데 치중하고 있으며 이런 유전자 무리들은 공통적인 promoter motif, transcription factor, function, signal transduction pathway를 가질 가능성이 상당히 높다 (DeRisi et al., 1997). Practical approaches of microarray (1) 현재 상당히 많은 sequencing project가 식물체를 중심으로 진행중이며, 이중 많은 유전자가 sequencing homology를 바탕으로 기능 (functional annotation)이 부여되고 있다. 그러나 microarray를 이용해서 여러 가지 환경, 발달 단계에서의 유전자의 발현 양상을 비교 분석하면 단순히 sequence based functional annotation 보다 정확히 기능을 예측할 수 있을 것이다. 이렇게 부여된 기능은 over- or under expression 된 형질 전환체를 통해 확인될 것이다. (2) Microarray를 통해 식물체 집단 (plant population)을 screening 해서 ?olymorphic expression fingerprint辣?찾아낼 수 있는데 이러한 정보는 식물체의 유전정보 (natural accession, transgenic line, mutant, near-isogenic line, substitution line)와 합해져서 식물체의 특정 process에 관여하는 유전자나 유전자군을 찾을 수 있을 것이다 (Kehoe et al., 1999). (3) 특정물질의 처리 효과, 여러 가지 환경요인 효과, developmental stage를 microarray를 통해 분석하면 그 결과가 quantative하고 미세한 유전자 변화가 감지된다. 더군다나 변화가 없거나 reduce되는 유전자군도 동시에 감지할 수 있다. 이렇게 광범위한 유전자 발현 양상의 변화는 식물체의 기본적인 생리현상의 과정에 대한 이해의 폭을 넓히며, heterosis처럼 intractable, complex trait에 대한 연구를 가속화시킬 것이다 (Kehoe et al., 1999). (4) 식물체의 어떤 현상을 이해하기 위한 marker 유전자로 사용되는 범위가 현재는 상당히 제한되어 있다. 그러나 microarray를 이용하면 상당히 많은 수의 marker 유전자를 발굴할 수 있다 (Schena, 1996). 이런 marker 유전자는 돌연변이체 발굴이나 plant response를 monitor하는데 강력한 tool로 이용될 수 있다. Conclusion 현재 genome sequencing program을 통해 계속 발견되는 sequence information은 직접 microarray에 spotting되는 raw material로 그 중요성이 있으며, 또한 sequence 그 자체는 analysis tool을 이용해서 기능을 예측하는데 이용된다. 이에 반해 최근에 개발된 Microarry는 차별화 된 유전자 발현을 분석해서 그들의 기능을 추정하는 tool로서 현재 개발된 방법 중 가장 강력한 tool이다. 현재 plant biologist는 아주 제한된 분야의 연구를 통해 제한된 정보를 알고 있다. 더군다나 식물체의 발달과 성장은 아주 복잡하고 통합된 과정이다. 따라서 sequence information과 microarray information을 통합하면 식물체 내외의 변화에 따른 생리적 변화에 대한 통합적인 이해의 틀을 제공해준다. 지금까지 개발된 microarray 분석법은 mRNA transcripts 수준에 제한되어 있다. 그러나 여기에다 현재 급속히 발전중인 proteomics (large scale parallel analysis)나 protein chip의 정보를 합하면 보다 풍부한 생리학적 정보를 얻을 수 있다. 예를 들면 proteomics는 microarray에서 볼 수 없는 단백질 (gene product)의 modification까지 감지할 수 있다. 따라서 Sequence, microarray, proteomics, metabolic profiling 등으로부터 얻어진 통합적인 정보는 plant biologists에게 여태까지 경험하지 못한 새로운 연구 접근법을 요구하고 있다. References 1. Alon, U., Barkai, N., Notterman, D. A., Gish, K., Ybarra, S., Mack, D., and Levine, A. J. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 6475-6750. 2. 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