[서론]

  오믹스학(Omics)은 생명체 내 복잡하게 얽힌 생분자 네트워크의 총체적인 분석을 가능케한다는 이점으로 인해 다양한 분자생물학 연구에 적극적으로 활용되어왔다.[1] 오믹스학은 대체로 수많은 생분자의 정성 및 정량 분석을 통해 그 중 유의미한 타깃을 선정하는 하향식(Top-down) 접근법으로 세포 대사에 대한 이해도를 높이거나, 새로운 약물 타깃을 발굴하거나, 타깃을 재설정(Drug repurposing)해왔다.[2] 생체 조직 내 분자 특성을 밝히고자 수행되는 오믹스학 연구의 경우, 관심 지역(Region of interest)의 모든 세포를 개별 대상으로 설정하여 수행되는 것이 이상적일 것이나, 이는 기술적 한계로 인해 불가능에 가까웠다. 대안으로, 최대한 세부 조직을 나눠 절제하거나 동일한 종류의 세포를 증식시켜 오믹스 데이터를 얻는 방식으로 연구가 수행되어왔다. 그러나 Deep sequencing 기술의 발달과 함께 보다 효율이 높은 단일 세포 분류 및 분석 기술이 개발되면서 이와 같은 연구 방법의 한계점이 드러나기 시작했다. 예컨대, 형광표지세포분류를 통해 분리된 Microglia 사이에서 발견된 분자적 세포 다양성(Cellular diversity)[3]과 암 조직에서 발견되는 종양 내 이질성(Intratumor heterogeneity)[4] 등이 대두되어 학계에 발표되기 시작한 것이다. 이러한 흐름에 따라 최근의 연구자들은 여러 단일 세포들로부터 얻어진 정보가 합쳐진, 그로 인해 중요한 정보가 희석되었을 가능성이 높은 데이터에서 벗어나 단일 세포 수준에서 수집한 오믹스 데이터를 분석하려는 노력을 경주하고 있다.

  다양한 오믹스학 중 단백질의 총체, 즉 단백체의 발현 정보를 제공하는 단백체학의 단일 세포 분석에의 적용 역시 활발히 시도되고 있다. Cytometry by time of flight(CyTOF) 등 항체를 이용한 단일 세포 단백체학은 높은 민감도를 갖고 있기에 단일 세포 시료에 우선적으로 적용되었으나, 이 방법은 연구자가 사전에 설정한 제한적인 수의 단백질만을 대상으로 하며 설정 타깃에 대한 적합한 항체가 확보되어야 한다는 한계점을 갖는다.[5] 반면, Liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) 기반의 단백체학은 분석 민감도 범위 내 모든 단백질의 존재량을 측정한다는 특징으로 인해 다양한 세포 아형(Cellular subtype)의 분자적 특성을 규명하고 새로운 아형을 발굴하려는 단일 세포 오믹스학의 목적에 보다 부합한다.[6, 7] 따라서 단일 세포의 LC-MS 분석이 단일 세포를 구성하는 미지의 단백체 정보를 제공할 것이라는 기대가 높아짐에 따라 기술 현황에 많은 관심이 집중되고 있다. 본 기고문에서는 최신 LC-MS 기반 단일 세포 단백체학의 대표적인 기술들을 알아보고, 앞으로의 전망에 대해 논하고자 한다.

✓ 단일 세포 단백체학 기술 현황

  단일 세포 단백체학은 단백체의 LC-MS 분석에 충분한 단백질의 양을 확보할 수 있는 큰 세포에서부터 시작되었다. Hughes 등은 Magnetic bead의 표면 처리를 통해 시료 손실을 최소화하는 전처리 방법을 고안해 초파리 배아(Embryo)에서 약 5,600개 단백질을, Nemes 등은 개구리(Xenopus)의 16-세포기 배아에서 약 1,700개 단백질을 검출한 결과를 발표하였다. 이 연구들은 극미량의 단백질로도 단백체학 분석을 가능케하는 분석 민감도를 확보하였다는 점에 의의를 갖지만, 분석에 사용된 세포를 진정한 단일 세포로 볼 수 없다는 한계점이 있다.[8, 9] 그 후 Virant-Klun 등이 인간 난자(Oocyte)의 단백체를 분석해 및 약 450개 단백질을 동정(Identification)한 결과를 발표하면서 인간 단일 세포 단백체학의 포문을 열었다.[10] 이와 같은 연구 논문으로 미루어 봤을 때, 단일 세포에서도 심도 있는 단백체 분석이 가능하다고 볼 수 있으나, 이를 위한 실험에는 실험자의 시간과 노력이 상당량 소요되므로 (시료당 약 4시간의 실험이 필요) High-throughput 분석으로 분류하기에는 어렵다.

  조직을 구성하는 세포군을 분자 발현 특성에 따라 여러 아형으로 구분하고, 알려지지 않았던 희귀 세포 아형을 발굴하기 위해서는 충분히 많은 수의 단일 세포의 분석이 요구된다. 개인적인 공동 연구 경험에 의하면, FACS를 이용해 잘 알려진 방식으로 분류한 세포 시료의 경우에 1,000개 단일 세포의 분석을 최소 요구치로 보는 경우도 있었다. 따라서 자동화된 작업흐름 및 높은 재현성과 범용성이 확보된 High-throughput 단일 세포 오믹스학의 개발에 많은 관심이 모아지고 있다. 이러한 단일 세포 단백체학 분석 개발을 선도하는 Slavov의 연구팀과 Kelly의 연구팀은 같은 목적을 향해 서로 다른 접근법으로 단일 세포 단백체학을 시도하여 결과를 발표한 바 있다. Northeastern 대학의 Slavov 등이 발표한 SCOPE-MS라는 분석법은 FACS를 이용해 단일 세포를 Microwell plate의 Well에 하나씩 도포한 뒤, 각 단일 세포에서 단백질을 추출하고 변성시키고 펩타이드로 제한(Digestion)한다.[11] 그리고 각 단일 세포에서 유래된 펩타이드 시료에 서로 구분되는 고유 질량을 갖는 Tandem mass tag(TMT^TM, Thermo Fisher Scientific)라는 동위원소표지자를 부착한다. 다음으로 펩타이드 시료들을 하나로 취합하는데, 동위원소표지자로 인해 각각의 단일 세포에서 유래된 펩타이드는 질량분석기 내에서 서로 구분되어 분석된다. 개별 단일 세포를 각각 분석할 때에는 질량분석기의 민감도 한계로 인해 분석되기 어렵다는 한계점을 시료를 취합하여 신호 강도를 높이는 방식으로 극복하는 전략을 취한 것이다. Slavov 연구팀은 분석법의 모든 과정을 최적화한 SCOPE-MS2라는 분석법을 3년 뒤 발표하였고, Macrophage로 분화 중인 Monocyte 약 1500개에서 약 3000개 단백체 발현 변화를 단일 세포 수준에서 측정한 결과를 발표하였다.[12] 미(美) 정부 에너지부 산하 Pacific Northwest 국립연구소의 Kelly 등이 개발한 단일 세포 단백체학 분석법은 NanoPOTS(Nanodroplet Processing in One pot for Trace Samples)라고 명명되었으며, 여기에는 Picoliter 수준의 액체를 정확히 다룰 수 있는 미세유체역학 장비와 자동화된 작업을 위한 로봇 팔이 결합된 장치가 사용된다.[13] 추가로 이 연구팀에서는 소수성 Slide 안에 나노 단위의 크기를 갖는 수십-수백 개 친수성 홈이 설계된 Slide를 개발하였다. FACS를 비롯한 단일 세포 분류기를 통해 세포를 분류할 때, 이 홈에 단일 세포를 포함하는 Nanodroplet이 올려지고, 이 Droplet 안에서 단백질의 추출과 제한 등의 전처리가 이뤄지므로 시료의 손실이 최소화된다. (그림) 또한, 자체적으로 개발한 Graphical user interface(GUI)를 이용하면 실험 및 LC-MS로의 주입 과정을 자동화하고 통제할 수 있다. 따라서 실험자의 개입을 최소화하면서 하루에 최대 수백 개의 단일 세포를 전처리 및 분석할 수 있다. 초기의 NanoPOTS 분석법은 위에서 언급되었던 동위원소표지자를 사용하지 않는 비표지분석법(Label-free analysis)로 개발되었다. 이 분석법은 식물 세포, Circulating tumor cell, 그리고 laser-capture microdissection으로 수집된 조직 등 다양한 시료의 분석에 적용된 바 있다.[14-16]

  두 연구팀은 서로 다른 접근법으로 단일 세포 단백체학 분석법의 개발을 선도하고 있지만 여기에서 재미있는 점은 시간이 흐름에 따라 각 팀이 분석법을 개선하기 위해 상대 연구팀의 분석 전략을 취하려 하고 있다는 점이다. Kelly 연구팀이 이후 개발하는 분석법에서는 신호 강도를 확보하면서 동시에 보다 많은 수의 단일 세포를 분석하기 위해 동위원소표지자를 적용하였고,[17, 18] 반대로 Slavov 연구팀에서는 표면 접촉으로 인해 시료의 손실이 야기되는 Microwell plate를 사용하지 않고 NanoPOTS와 유사하게 나노 크기를 갖는 Droplet 내에서 단백질 시료를 전처리하는 방향으로 기술 개발을 진행하고 있다는 점이다.[19] 그러면서 두 연구팀 모두 세포 분류, 도포, 그리고 전처리를 위한 Reagent handling을 자동으로 수행하는 CellenONETM (Scienion) 장비를 적극 활용하면서 분석 효율의 극대화를 노리고 있다는 점도 눈여겨볼만 하다.

   그 밖에는 독일의 저명한 단백체학 연구팀인 Mann의 연구팀에서 True Single Cell Proteomics(T-SCP)로 명명한 분석법을 개발하여 발표한 바 있다.[20] 이 방법에서는 위에서 소개한 SCOPE-MS와 같이 단일 세포가 384-well plate 안에서 전처리된다. 다른 점은, 전처리된 펩타이드 시료가 부분적 자동화된 방식으로 Stage-Tip을 거쳐 LC-MS로 전달되게끔 설계되어 하루에 40개의 단일 세포를 비표지분석하도록 설계되었다는 점이다. 연구팀에서는 이 분석법을 이용해 231개 HeLa 세포에서 약 2,500개 단백질을 검출하였고, 각 세포가 놓여있는 서로 다른 세포 분열 주기에 따른 단백체 구성을 분석하여 주기에 따라 겪는 양적인 변화를 탐색하였다.

✓기술 전망

  위에서 소개한 사례 외에도 다양한 기술 개발이 이뤄지고 있으며, 저마다 다른 방식으로 High-throughput 분석을 이루고자 한다. 그럼에도 불구하고 현재까지 발표된 문헌을 조사했을 때, 분석 방식과 데이터 처리 방식에 따라 상이하지만, 분석 가능한 단백질의 수는 적게는 1,000개에서 많게는 3,000개 수준에 불과하다. 또한 대부분의 방식에서 단일 세포 분류부터 LC-MS 분석까지의 과정에 대해 자동화가 부분적으로만 이뤄졌기 때문에 재현성이 충분하지 않으며, 실험자의 개입 없이 짧은 시간 내에 분석할 수 있는 단일 세포의 수는 극히 적다. 개인적인 의견으로는, 이러한 문제를 해결하기 위해 단백체학 연구자들이 나름대로의 Breakthrough를 위해 고뇌하는 한편, 단백질 시료 손실을 최소화하기 위한 표면 처리를 연구하는 화학자, 미세공정의 자동화를 연구하는 공학자, 그리고 분석 민감도 확보를 위해 노력하는 LC-MS 개발자들과 밀접하게 공동 연구를 수행해야 할 것으로 생각한다.

   단일 세포 수준에서 수집한 단백체학 데이터는 단일 세포 유전체학 데이터에 상보적인 데이터가 될 뿐만 아니라 세포 내에서 실제 기능을 하는 단백질의 정보를 제공하므로 그 자체로도 귀중한 정보이다. 그러나 단일 세포 단백체학 기술의 현황은 20,000개 이상의 단일 세포를 분석하여 다양한 아형을 발굴하는 단일 세포 RNA-seq 기술과 비교하면 갈 길이 수만 리는 된다고 할 수 있겠다. High-throughput 단일 세포 단백체학 분석 기술이 확보되어 단일 세포의 다중 오 믹스가 가능해지면, 초고해상도의 분자 기전 정보를 통해 세포 다양성이라는 장막에 가려져 흐릿하게 보였던 생명 현상들을 명확하게 밝혀줄 것으로 전망되고 있다. 이를 위한 길이 비록 험난할지라도 단일 세포 단백체학 연구자들이 가야 할 길이 아닐까.

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