[서론]

  안티센스 올리고뉴클레오타이드 (antisense oligonucleotide, ASO)는 일반적으로 16~22개의 뉴클레오타이드로 구성되며, ASO의 염기서열에 따라 목적 RNA에 결합하여 작용한다. 세포 내에 존재하는 RNase H 효소를 통하여 표적 RNA를 분해하거나, RNA의 스플라이싱, 번역을 조절하는 작용기전으로 표적 RNA를 감소 또는 증가시킨다. 최종적으로는 RNA와 RNA로부터 만들어지는 단백질 발현 조절을 통하여 질병을 치료하고자 하는 목적으로 활발히 연구되고 있다[1]. 특히 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드가 도입되면서 효능은 높이고 부작용을 줄여 약물학적 특성을 향상시키고 있다[2]. 2016년 척수성 근위축증 치료제인 Nusinersen이 승인된 이후 23종의 ASO 약물들이 중추신경계 (central nerve system, CNS) 질병 치료제 개발을 위하여 3상을 포함한 임상시험 진행 중이다[3]. 대부분의 CNS 질병이 독성을 유발하는 유전적 변형의 획득에 의해서 발병하므로 ASO를 이용하여 독성을 유발하는 RNA 또는 단백질을 제거하는 것은 효과적인 치료 접근법이다[4]. ‘만약 ASO가 뇌 조직에서 표적 RNA를 50% 감소시킨다면 모든 세포에서 50%의 RNA가 감소한 것일까? 아니면 조직내 세포 중 절반에서 100%의 RNA가 감소한 것일까?’ 라는 오래된 질문에 대하여 마우스와 영장류의 뇌 조직을 단일 세포 수준에서 분석하여 그 답을 제시한 최근 연구를 소개하고자 한다.

[본론]

   뇌실투여 (intracerebroventricular injection) 또는 척수강내투여 (intrathecal injection) 방법으로 CNS 공간으로 직접 전달된 ASO는 뇌와 척수를 포함한 CNS 조직에 도달하고 각 세포내로 유입되어 효과를 나타낸다. CNS 질병 치료제 개발이 활발한만큼 조직과 세포수준에서 ASO의 분포와 효과를 밝히고자 하는 연구가 많이 진행되어왔다. 마우스, 래트, 영장류의 CNS 조직 전체영역으로 ASO가 분포하며, 표적 RNA의 감소효과를 나타나내는 것이 면역염색법과 in situ hybridization 방법을 통하여 확인되었다. 세포수준에서는 neurons, oligodendrocytes, microglia, astrocytes 세포종류에 ASO가 전달되어 효과를 보인다[5]. 하지만 기존 연구는 제한된 종류의 특정 세포만을 관찰할 수 있었고, 감소효과를 정량적으로 분석하기 어렵다는 한계가 있다. 그러므로 단일 세포 분석을 통하여 ASO 효과를 살펴보는 것은 기존의 한계점을 극복할 수 있는 혁신적인 접근법이다. 폐 조직의 경우 마우스에 ASO를 기도투여 (intratracheal instillation) 한 후, 폐 세포를 분리하고, 단일 세포 RNA 서열분석 (single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)을 적용하여, 여러 세포종류 중 fibroblasts에서 높은 표적 RNA 감소효과를 보이는 것이 밝혀졌다[7]. Vallabh와 Minikel 연구그룹의 최근연구는 마우스와 영장류 조직에서 단일 핵 RNA 서열분석 (single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq)을 시행하여 CNS 조직에서의 ASO 효능을 단일 세포 수준에서 연구하였다[그림][7].

   Long non-coding RNA인 Malat1 RNA와 프리온 질환의 원인 단백질인 PrP를 만드는 Prnp RNA를 절단하여 분해시키는 ASO가 분석을 위하여 사용되었다. Malat1은 높은 활성과 생체내 특성이 잘 알려진 ASO 서열이 알려져 있어 널리 사용되는 표적 RNA이다[5]. 특히 마우스 전사체 중 11.4%를 차지할 만큼 높은 발현량을 가지고 있으므로 많은 수의 RNA 분석이 어려운 단일 세포 분석에서도 정량적 분석이 가능하게 한다. Prnp는 프리온 질환 모델 마우스에서 치료효과를 보인 ASO를 이용하므로 기존의 연구결과에 대한 더 깊은 이해를 가능하게 하고, ASO 치료제 연구에서 단일 세포 분석이 지니는 의의를 보여준다[8]. 마우스의 소뇌, 대뇌피질, 시상과 영장류인 게잡이 원숭이 (cynomolgus macaques)의 소뇌, 대뇌피질이 분석대상이 되어, 총 598,066개의 단일 핵이 분석되었으며, 세포종류 마커 유전자의 발현에 따라 각 조직별로 9~14 종류의 세포로 구분되었다. ASO 투여 그룹과 ASO를 투여하지 않은 그룹에서의 표적 RNA 발현량을 비교하여 ASO의 효과를 정량적으로 분석하였다.
표적 유전자의 감소는 마우스와 영장류 모두 세포의 종류에 따라 정도의 차이는 있으나, 일부 세포에서만 집중적인 효과를 보이는 것이 아니라 분석된 모든 세포종류에서 감소효과가 관찰되었다. Malat1 ASO를 투여한 마우스 소뇌 조직은 14 종류의 다른 세포종류로 분류할 수 있었고, 이때 각 세포종류에서 남아있는 Malat1 RNA의 양은 7~76%였다. Prnp ASO를 마우스에 투여 후 측정한 Prnp RNA의 감소효과의 경우 세포종류별 차이는 소뇌 조직에서 가장 두드러졌는데, Purkinje cells, molecular layer interneurons (MLIs)에서 granule cells에 비해 높은 감소효과를 보였다. 뇌 조직 전반을 걸쳐서는 endothelial stalk cells, pericytes, fibroblasts 세포종류에 많은 양의 Prnp가 남아있어 상대적으로 낮은 ASO 활성을 보였다. 영장류에서의 결과를 분석해보면 대뇌피질에서는 neurons에서 감소효과가 가장 높았고, endothelial stalk와 pericytes/fibroblasts에서 감소효과 낮았다. 소뇌에서는 Purkinje cells와 MLIs에서 효과가 높고, pericyte/fibroblasts에서 효과가 낮았다. 이러한 결과는 마우스 그리고 영장류에서 세포종류에 따른 ASO 활성의 경향이 일치함을 나타낸다. 세포종류별 ASO의 활성 차이가 나타나는 기전을 밝히기 위하여 ASO에 의한 절단을 담당하는 효소인 Rnaseh1 발현, 세포의 크기를 반영하는 세포당 unique molecular identifier (UMI) 숫자, 표적 RNA의 기저 발현량을 분석하였으나, ASO의 활성과 상관관계가 없었다.
CNS 조직에서 단일 세포 수준의 ASO 활성을 살펴본 연구결과는 프리온 질환의 치료제 개발에 있어서 중요한 시사점을 제공한다. Neurons에서의 PrP 단백질 축적이 프리온 질환의 직접적인 원인이다. 그러므로 치료효과를 얻기 위해서는 반드시 neurons에서 PRNP 유전자 감소를 유도할 수 있고 이를 모니터링할 수 있어야 한다. 하지만 임상연구 과정에서 얻을 수 있는 검체는 제한적으로, 뇌척수액 (cerebrospinal fluid, CSF)이 많은 경우 유일한 시료이다[9]. ASO 투여 후 게잡이 원숭이의 CSF에서 PrP 단백질은 40% 감소하였으며, 이는 neurons을 포함한 모든 CNS 세포에서 감소된 PRNP RNA를 반영한 결과이다. 단일 세포 분석 결과에서 모든 유형의 neurons에서 PRNP RNA가 40% 정도 또는 이보다 훨씬 높은 감소를 보였으므로, CSF에서의 PrP 단백질 측정이 neurons에서의 PrP 감소를 모니터링할 수 있는 바이오마커로 활용될 수 있음을 보여준다.

[맺음말]

  이 연구는 ‘CNS 조직으로 전달된 ASO가 각각의 세포에서 어떻게 작용할까?’ 라는 오래된 질문에 대한 직접적인 답을 제시하고 있다. 연구에 활용되는 기술의 발전과 함께 올리고뉴클레오타이드 치료제 연구 분야에서 오랫동안 가지고 있었던 질문들에 대한 대답이 점차 등장하고 있다. 또다른 예로는 ‘어떻게 올리고뉴클레오타이드 치료제는 1회 투여로 경우에 따라 6개월 이상 지속되는 오랜 작용기간을 나타낼 수 있을까?’ 라는 질문이 있다. 이 역시 최근 연구에서 endocytosis를 통하여 세포내로 유입된 siRNA의 일부가 endosome에 보관되었다가 천천히 세포질로 분비되면서 오랜 작용기간에 기여한다는 것이 실험을 통하여 증명되기도 하였다[10]. 새롭게 밝혀지는 사실들을 통하여 올리고뉴클레오타이드 치료제에 대한 더 깊은 이해가 이루어지고, 이를 바탕으로 치료제 개발이 더욱 촉진되기를 기대한다.

참고문헌

• 1.

  Bennett, C. F. & Swayze, E. E. RNA targeting therapeutics: molecular mechanisms of antisense oligonucleotides as a therapeutic platform. Annu Rev Pharmacol Toxicol 50, 259-293, 2010.

• 2.

  Khvorova, A. & Watts, J. K. The chemical evolution of oligonucleotide therapies of clinical utility. Nat Biotechnol 35, 238-248, 2017.

• 3.

  ClinicalTrials.gov, accessed February 13, 2023.

• 4.

  Bennett, C. F., Kordasiewicz, H. B. & Cleveland, D. W. Antisense Drugs Make Sense for Neurological Diseases. Annu Rev Pharmacol Toxicol 61, 831-852, 2021.

• 5.

  Jafar-Nejad, P. et al. The atlas of RNase H antisense oligonucleotide distribution and activity in the CNS of rodents and non-human primates following central administration. Nucleic Acids Res 49, 657-673, 2021.

• 6.

  Shin, M. et al. Intratracheally administered LNA gapmer antisense oligonucleotides induce robust gene silencing in mouse lung fibroblasts. Nucleic Acids Research 50, 8418-8430, 2022.

• 7.

  Mortberg, M. A. et al. A single-cell map of antisense oligonucleotide activity in the brain. Nucleic Acids Research gkad371, 2023.

• 8.

  Minikel, E. V. et al. Prion protein lowering is a disease-modifying therapy across prion disease stages, strains and endpoints. Nucleic Acids Res 48, 10615-10631, 2020.

• 9.

  Vallabh, S. M., Minikel, E. V., Schreiber, S. L. & Lander, E. S. Towards a treatment for genetic prion disease: trials and biomarkers. Lancet Neurol 19, 361-368, 2020.

• 10.

  Brown, C. R. et al. Investigating the pharmacodynamic durability of GalNAc-siRNA conjugates. Nucleic Acids Research 48, 11827-11844, 2020.

저자약력