1. 서론

   정밀의료 (Personalized Medicine)의 개념은 주로 유전체학 (Genomics)과 전사체학 (Transcriptomics)기술을 통해 구축되었고, 이는 다양한 종의 질환에서 다양한 유전자의 변이 (mutation)를 동정하는 결과로 이어졌다. Next-generation sequencing (NGS) 기술의 비용의 급감은 대량의 유전체 데이터 생산으로 이어지고 다양한 질환의 이해를 증진시키는 기회가 되었다 (1). 특히, 암의 경우, Cancer Genome Atlas (TCGA) 와 International Cancer Genome Consortium (ICGC)를 통해서 다양한 암 유형에 걸쳐 수천개의 종양시료에서 유전체 데이터를 확보하였고, 이를 통해 새로운 발암유전자 (oncogenes) 와 암억제 유전자 (tumor suppressor genes) 를 발굴하는 성과를 보였다 (2). 또한, 많은 회사들은 이런 유전체 데이터를 활용하여 신약 타겟을 선별하는 과정에 활용하거나, 개인의 유전자 염기서열 분석 검사 (personalized sequencing)를 활성화하는 등으로 확장이 이뤄지고 있다 (3).

   그러나, 다양한 유전자의 변이들과 질환과의 연관성은 NGS의 유행전에 이미 많은 경우 알려져 있던 것이 많다 (4). 전반적의 암의 유전체 데이터는 약 3분의 1의 암 환자에서 중요한 유전자의 변이를 식별하는 것에 성공했지만, 그 중 아주 일부의 환자만이 임상적인 효과를 보였다 (5). RNAseq을 통한 NGS의 전사체 수준으로의 확장은 fusion gene이나 mRNA의 발현 차이 등 좀 더 많은 정보를 제공하였고, 이를 통해 DNA sequencing 정보와 함께 잘 알려지지 않은 내용들을 밝혀 낼 수 있었다.

2. 단백체학 기술의 현황

   1994년 Mark Williams에 의해 단백체학 (Proteomics)가 처음 언급된 이후 (6)에, 현재까지 관련 기술은 눈부신 성장을 이루고 있다. 인간 게놈 프로젝트 (Human genome project)의 최초 발표와 함께, 인간의 건강과 질병의 병태생리학적 기전을 포괄적으로 이해하기 위해 인간 프로테옴 (Human proteome)에 대한 정보가 필수적이고 이를 이용한 단백체 연구가 필수라는 공감대가 형성되었다 (7). 이 목적을 달성하기 위해, Human Protein Organization (HUPO), National Cancer Institute’s Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC), Early Detection Research Network (EDRN), SEER cancer database, Applied Proteogenomics Organizational Learning and Outcomes (APOLLO) network, International Cancer Proteogenome Consortium (ICPC, Cancer Moonshot) 등의 다양한 이니셔티브 (initiative) 들이 전세계적으로 만들어졌다. 최근에는 SEER, Olink, Somalogic, Biognosys, Nautilus 등의 해외 기업뿐만 아니라, 국내에서도 베르티스, 프로테옴텍, 레티마크, 이노파마스크린 등의 단백체 기술을 기반으로 한 회사들이 기업 활동을 하고 있다.

   현재까지는 질량분석기 기반의 단백체학 기술들이 가장 활발하게 관련 분야에서 활용되고 있다. 다양한 기술들 중에서 Shotgun proteomics 혹은 bottom-up proteomics 라고 불리는 기술이 가장 많은 단백체 분야에서 활용되고 있으며, 시료 전처리, 질량 분석, 단백체 데이터 분석의 각 부분에서 눈부신 기술의 향상을 통해서 세포 혹은 임상 시료에서 약 10,000개 이상의 단백질과 10,000개 이상의 PTM sites를 동정 (identification)하고 동시 정량 (quantification) 하는 수준에 도달하였다 (8). 또한, 10 mg 이하의 미세 시료에서의 추출되는 단백질을 높아진 민감도의 질량분석이 가능해짐에 따라서 다양한 임상시료에서의 단백체 데이터 생산이 늘어나고 있고, 여러 암 종에서 코호트 수준의 시료 군에서 연구가 진행되고 있다 (9).

3. 정밀의료에서 단백체학의 역할

  단백질은 주어진 조건에 맞추어 유전체 정보에 충실하게 세포가 기능을 수행할 수 있도록 역할을 한 후 정해진 기간이 지나면 분해가 된다. 이와 달리, 암의 체세포 돌연변이와 같은 특별한 후생유전체의 경우를 제외하고는 태어날 때에 보유한 유전체 정보는 예외적인 경우를 제외하고는 거의 일생 동안 보존된다. 즉, 단백체 발현은 특정 개인정보 식별의 문제가 유전체와 같은 수준으로 보호할 필요가 없다는 점에서 인간 연구에서 비교적 더 자유스러울 수 있다. 같은 맥락에서, 유전체가 동일한 같은 종류의 세포라 할지라도 환경과 상태에 따라 단백체의 발현 양상은 변화하고, 그 발현 양상에 따라서 고유의 기능이 나타난다.

  이런 이유로 인해 기초의학 및 인간 임상 연구의 많은 경우는 이미 단백질을 중심으로 진행되고 있다. 예를 들어, MAPK, BRAF, VEGF, ALK, EGFR, PI3K 등을 타겟으로 하는 다양한 약들은 유전자 수준이 아니라 단백질 수준에서 타겟 단백질을 억제한다 (4). 질병의 발병 및 진행 기전과 밀접하게 연관되어 있는 인산화 효소 (Kinase)의 비정상적인 활성화 여부는 각 인산화 효소의 기질 단백질 (substrate)의 인산화 (Phosphorylation) 정도로 확인할 수 있는데, 인산화 단백체 (Phosphoproteomics) 기술을 통해서 수천개 이상의 인산화 변화 정보를 확인할 수 있다. 이를 통해 인산화 효소들의 활성화 정도와 다양한 세포내 신호 전달 체계 (Signaling pathway)의 변화를 한 눈에 확인할 수 있다. 또한, 유전자 발현 뒤에 일어나는 수식화 과정 (PTMs) 과 이를 통한 세포내 단백질의 위치 이동 (localization) 및 단백질의 분해 (degradation)에 대한 정보들은 단백체 분석을 통해서만 확인할 수 있으며, 단백질이 겪는 이런 과정들 때문에 단백질의 발현량과 전사 물질 (Transcript) 와의 양적 연관성이 높지 않음이 확인되었다 (10-11). 마지막으로, 임상에서 진단과 치료를 위해 진행하는 대부분의 실험실 검사 (laboratory test)는 일반적으로 단백질을 기반으로 시행된다 (12). 실제로, 암 진단 및 종양 단계 구분, 치료 결정을 위해 진행하는 조직 면역 염색 (immunohistochemistry)는 조직의 단백질 마커에 대한 염색을 진행한다. 따라서, 직접적으로 단백질의 양적 변화와 수식화 (modifications)의 변화를 측정하는 것이 질병의 상태를 특정하기에 가장 효율적이라는 것을 알 수 있다.

  활용도 측면에서도 DNA, RNA 등의 유전물질에 비해 단백질은 분석에 안정적으로 알려져 있다 (10). 실제로 단백질의 높은 안정성과 취급용이성은 FFPE 시료에서의 단백질 추출 후 질량분석기 분석을 통해서 안정적인 데이터 생산이 가능함이 확인되었다. 심지어, 30년이 넘은 FFPE 조직 시료에서 인산화를 포함한 단백질의 동정 및 정량이 성공적으로 진행됨이 확인되었다 (14). 이처럼, 질량분석기 기반의 단백체학은 새로운 바이오마커의 개발뿐아니라 임상의의 예후 및 예측력을 향상시키는데 높은 활용 가능성이 있음을 시사하고 있다.

4. 최신 단백체학 기술

  높은 특이도 (specificity), 민감도 (sensitivity), 정밀도 (accuracy) 로 인해서 질량분석기는 대규모 비표적 단백체 분석에서 가장 많이 사용되고 있다 (15). 전형적인 질량분석기 기반 비표적 단백체학 (unbiased proteomics) 분석 플랫폼은 시료 전처리, 질량분석기를 사용한 데이터 생산 및 데이터 분석으로 진행되어진다. 시료 전처리의 경우, 다양한 생물학적 시료에서 단백질을 효율적으로 추출한 후, 시스테인 (Cysteines) 잔기의 환원 반응 (reduction) 및 알킬화 반응 (alkylation)을 통해 이황화 결합 (disulfide bond) 을 붕괴시키고 트립신 (trypsin) 으로 대표되는 분해 효소를 사용하여 단백질들로부터 펩타이드를 생산한다. 시료 전처리 단계에서 자동화와 재현성 향상을 위해서 단일 장치에서 실험이 가능한 FASP, iST, SP3, sTRAP등 의 기술이 개발되었고, 이를 통해 전처리 시간 감소, 시료 오염 및 손실 감소, 처리량 증가등의 눈에 띄는 기술 향상이 이뤄졌다. 질량분석기를 통한 PTM 의 분석을 위해서는 추가적인 전처리과정인 농축 과정 (enrichment step) 이 필요하다. 농축 과정은 전하 성질 (charge properties) 나 항체-항원 인식등의 친화성 (affinity) 기반으로 이뤄진다 (16-17). 인산화의 경우, AssayMAP 로봇 기술등을 이용하여 1시간에 96개의 시료에서 인산화 농축을 진행할 수 있는 수준이다 (18).

  시료 전처리를 통해 생산된 펩타이드에서 다양한 질량분석 방식을 통해서 데이터를 생산할 수 있다. 가장 오랫동안 사용되고 있는 data-dependent acquisition (DDA) 방식의 데이터 획득 방식은 각 질량 스캔에서 가장 양이 많은 펩타이드에서 우선적으로 MS/MS 스펙트럼을 확보하는 방식이다. DDA 방식의 단점인 적은 양의 펩타이드는 MS/MS 스펙트럼을 얻을 기회가 없다는 단점을 극복하기 위해 DDA 기반의 BoxCar 등 새로운 데이터 획득 방식이 개발되어 약 10배 수준의 단백체 다이나믹 레인지 (Dynamic range)를 확보할 수 있게 되었다 (19). 최근에는 Data-independent acquisition (DIA) 방식의 질량 분석을 통해서 missing value 문제, 재현성 및 정량성 문제까지 해결하기 위한 시도를 진행하고 있다. DIA 방식은 특정 m/z 범위안의 모든 펩타이드의 MS/MS spectrum을 확보하는 방식으로 진행되며, 생물정보학 툴을 사용하여 복잡한 MS/MS 스펙트럼을 해석해 펩타이드 서열 및 양적 정보를 추출하는 방식이다 (20).

  앞에 열거한 비표적 단백체 분석 기술 이외에도 표적 단백체 (Targeted proteomics) 기술도 개발되었다. 미리 선별된 펩타이드 정보에 대한 높은 특이도와 재현성 있는 데이터 확보를 위하여 질량분석기 기반의 다중검지반응법 (multiple reaction monitoring) 기술이 개발되었다 (21). 최근, 질량분석기외에 친화도 기반 기술인 오링크사의 근접연장검증 (PEA, Proximity Extension Assay) 와 소마로직사의 압타머 (aptamer) 기반 다중 검정법을 통해서 대규모 표적 단백체 데이터를 얻을 수 있는 기술이 개발되었다. 비록 표적 단백체학 시술은 새로운 바이오마커 개발에는 활용하지 못하지만 발굴된 바이오마커 후보군의 검증 (validation) 연구와 실제 임상에서의 검사에서 크게 활용되고 있다.

  질량분석법등의 단백체 데이터 생산기술의 발전과 함께 관련된 소프트웨어의 개발도 진행되고 있다. 다양한 분석 소프트웨어들이 높은 성능뿐만 아니라 사용자 친화적으로 발전하고 있다. 특히, 대규모 데이터들의 처리 및 다른 종류의 오믹스 데이터와의 결합에 초점을 맞춰 다중 오믹스의 성격에 적합한 방식으로 발전하고 있다 (22).

5. 임상으로의 적용

  질량분석기 기반의 단백체학 연구 기법은 암, 만성질환등 다양한 질환의 바이오마커와 신약 타겟의 발굴 연구에 이미 광범위하게 사용되고 있다. 최근에는 관련 기술의 발전과 함께 직접적으로 임상에 적용할 수 있는 다양한 시도들이 이어지고 있다 (23-24). 현재까지 가장 집중적으로 연구가 진행되고 있는 분야는 혈액등 체액의 Liquid biopy 시료에서의 단백질 바이오마커 개발이다 (25). 혈액의 비침습적인 특성으로 인해서 조직 검사등에 비해 많은 장점이 있다. 하지만, 알부민 (albumin) 등 몇몇 단백질의 양이 전체 혈액 단백질의 70-80% 이상을 차지하는 혈액 단백질 구성의 특성으로 인해서 기술적인 어려움이 있다. 이런 기술적인 어려움은 최근 질량분석기의 발전 및 시료 전처리 기술의 발전을 통해서 많이 극복이 된 상태이며, 소량의 혈액에서 수천개의 단백질을 동정하고 정량할 수 있는 기술들이 최근 개발되고 있다 (26). 또한, Multiple Reaction Monitoring (MRM) 기술을 사용하여 표적 혈액 단백질의 정밀 동시 정량 기술이 개발되고, 실제 임상에서 사용되고 있는 진단 마커들에 적용이 되고 있다. 간암의 진단 마커로 임상에서 사용되고 있는 AFP 및 AFP-L3 등은 LiBA 방식의 전용 장비를 통해서 진단검사의학과를 통해서 임상 현장에서 사용되고 있다. 질량분석기를 사용한 AFP 와 AFP-L3 에 표적 펩타이드의 정밀 동시 정량을 통해서 LiBA 방식보다 높은 민감도와 정확도를 확인하여 신의료기술을 획득하였다 (27). 이처럼, 질량분석기 기반의 단백체학 기술은 임상에 바로 적용이 가능한 단백질 바이오마커의 개발뿐만 아니라 체외 진단이 가능한 측정 기술로서의 역할까지 수행할 수 있는 능력을 보여주고 있다.

6. 총론

  유전체와 전사체에 비해서 기술적인 완성도가 떨어지는 것으로 알려졌던 단백체학 분야는 최근 시료 전처리, 질량분석기, 데이터 분석등의 각 부분에서 괄목할만한 성장을 통해 많은 발전을 이뤄냈다 (28). 하루가 멀게 쏟아져 나오는 단백체학 연구 결과들은 임상에서의 적용 가능성이 점점 높아져 가고 있음을 보여주고 있다. 세포 내에서 거의 모든 분야의 기능을 담당하는 일꾼인 단백질의 특성을 분석할 수 있는 최첨단 단백체학 기술을 통해서 다양한 질환의 발병 및 진행 기전을 이해, 진단 및 예후 예측을 위한 바이오마커를 개발, 질병의 치료를 위한 신약 개발을 아우르는 정밀의료의 큰 목표를 이룰 수 있을 것으로 기대한다.

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저자약력 (김영수)

저자약력 (한도현)